Mark Alan Ruffalo urodził się 22 listopada 1967 roku w rodzinie włoskich imigrantów. Jego ojciec był malarzem budowlanym, a matka fryzjerką. Jako jedyny spośród rodzeństwa nie poszedł w jej ślady. Brat i dwie siostry również zajmują się zawodowo fryzjerstwem. Mark sam ma trójkę dzieci o uroczych imionach Keen, Bella i Odette.
Po ukończeniu szkoły średniej obrał drogę aktorską. Podczas studiów założył z przyjaciółmi Orpheus Theatre Company. W ramach realizacji pasji grywał, a dorabiał jako barman.
Zaczynał od seriali i nieprzebojowych produkcji telewizyjnych. W 2000 roku na ekrany wszedł film „Możesz na mnie liczyć”, za kreację w którym Mark zdobył pierwszą nagrodę przyznaną przez krytyków. Dalej angażowano go do pracy przy przeróżnych produkcjach – komediach, thrillerach, dramatach – „Zakładnik”, „Dziś 13 jutro 30”, „Z ust do ust”, „Zodiak”, „Niesamowici bracia Bloom”, „Miasto ślepców”, „Co cię nie zabije”, „Wszystko w porządku”, „Wyspa tajemnic”, „Avengers”, „Iron Man”, „Iluzja”, „Człowiek z bieguna”, „Foxcatcher”, „Spotlight”.
Po trzy razy nominowany był do Critics Choice, BAFTA, Złotych Globów i Oscarów, a nigdy żadnej z tych nagród nie zdobył.
W 2007 roku aktor powiedział: „Kiedy przygotowuję się do swoich ról, można to nazwać obsesją. Chcę wiedzieć absolutnie wszystko na temat postaci, którą mam zagrać, włącznie z najdrobniejszymi detalami. Oczywiście to dość łagodna forma fiksacji, jestem jednak w stanie wczuć się w sposób myślenia ludzi ogarniętych jakimś dążeniem”.